恩平市乳糖醇

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恩平市乳糖醇

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由于奇异果素的糖蛋白在果实中的含萤很低,它本身对温度和pH的变化又 很敏感,这就给分离与提纯带来很大的困难。早期报道的提取工艺由于残留有蛋 白酶活性,所以得率很低。其他方法则要求使用复杂的溶剂系统以及精细的纯化 步骤,即使这样,每吨浆果最多只可提纯出200mg左右的奇异果素。较大规模 提取时,lkg浆果通常只能获得50mg的产品。奇异果素本身对热及pH很敏感, 在低于PH3或高于PH12的室温环境下会失去活性。然而l(XVg的奇异果素就足 够提供持续延绵的增甜效果。实际应用时,1kg的浆果可提供数倍重虽蔗糖的 甜味。
多次有关甜蜜素的埃姆斯筛选试验也没发现仟何诱变现象,细胞转移试验也
FDA仍坚持最初所作出的批准决定,但在有可靠的科学证据证实两者之间 确存在问题时,FDA保留采取行动的权利。这种情况,对于任何需经由FDA批 准的产品均是如此。
二、罗汉果苷
③环原酸酯法(单基团保护法);
(五)剩余保护基团的脱除作用该反应是典型的酯交换反应,通常需在酸或碱的催化下进行,常用的催化剂 有硫酸、对甲苯磺酸、醇钠、氢氧化钠(钾)等。碱性条件下反应较完全,碱 催化脱酰基的机理如图3 -26所示。RC2H, R=庶糖基闭 R-= -CH,图3-26碱催化脱酰苺的反应机制
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶(GAP)基 因,其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh £co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段(-976? -1,推断+丨为翻译起始位点)作为启动子,用引物在V端加上N?d位点, 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段(+ 1006? + 1728)作为终止子,用引物在V端加上BamHI位点,在V端加上Pst丨位点, 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接,构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建:从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2,在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点,构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切,并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后,与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后,与含CYH抗性 基因的丨.1比?311-5&丨1片段(-184?+974)连接,构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到,用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域(+4?+356)和 3'区域(+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段,这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段,从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段,两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间,构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和?8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
也可以通过烟草表达莫奈林。首先合成了由噬菡体PI Cre重组酶介导的特异 ?组位点丨OXP的序列,构建了两个loxP同向重复的棺物表达栽体pGLX121. 1。 PCR定点突变了 CaMV 35S启动子元件中kozak序列,使kozak中的翻译起始密码 子ATG位于Ncol位点上。把spm基因克隆到表达载体pG〖MA的Ncol和PstI之 间,给甜蛋白8pm基因加上35S启动子和polyA及NOS终止子元件,然后克隆到 PGLX121. 1的EcoRI位点上,用农杆菌LBA4404转化烟草,获得卡那痗素抗性转 基因植株,经过PCR及southern分析,证明甜蛋白spm基因已整合到烟荩基因组 内。用转基因烟草的总RNA通过RT-PCR反转录扩增spm基因,证明了在35S启 动子及其他调控元件的控制下,spm基因在转基W烟草中转录表达出mRNA。提取 转基因烟草总蛋白,经SDS-PAGE分析,初步证明了 8pm基因在转基因烟草中表 达出目的甜蛋白。

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