临洮县阿力甜
(二）利用基因工程法生产奇异果素
合成色素中含有形状适宜的磺酸基，它能与嗦吗甜分子结合生成沉淀物。这 个反应与色素及嗦吗甜的浓度、pH和温度等条件有关。pH =5时，添加丨.5mg 嗦吗甜于丨OOmL的酒石黄、日落黄、AUura红色素、[0-与〇-红色素40、绿 色素S、丽春红-4K、靛蓝胭脂红或二蓝光酸性红之类合成色素（浓度lOOmg/ kg)中并没发生沉淀作用。但当用柠檬酸调节至PH2. 9?3. 2时，除绿色素S外 其余的均丧失了部分颜色。这种溶液若经杀菌处理（180弋，!5min),沉淀产生 得更快。
在进行代谢研究的同时，人们还对它的药物动力学进行了研究。试验是在白 鼠、狗和猪身上进行的，最后也在自愿受试人身上进行。所有的受试动物和人体
研究发现，PFR的生产效率一般要比CSTR的髙^当两者的合成速率相同 时，CSTR内部的反应条件与PFR出口处的反应条件相同，因此此时CSTR的 Z-Asp浓度较低，固定化酶内部pH比PFR入口处稍高。试验证实在CSTR中反 应可连续进行。图2-26显示在51 = 0.95外时，反应得率为90%可持续300多 小时。用上述条件，在lm3CSTR中，用400kg湿固定化酶，可生产10〖阿斯巴 甜。尽管固定化酶用于实际工业生产阿斯巴甜还存在许多问题，但这结果说明酶 法生产很有前景。如果能在PFR中实现连续化反应，则效率将会更髙。在另一 研究中，通过降低温度至25T,并同时降低底物浓度的方法，在PFR中实现了 连续化反应，在外=1. 85/h下固定化酶柱的稳定可保持500h。
图3-19 4-PAS浓度对 6-PAS得率的影响
ra 6 -19 各种不同取代基团的二氧硫氮杂环二氧化物及其钠盐的甜度 注：下标数字表示对蔗糖甜度的俏数.对照物是4%的蔗嬤液,
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶（GAP)基 因，其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh ￡co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段（-976? -1，推断+丨为翻译起始位点）作为启动子，用引物在V端加上N?d位点， 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段（+ 1006? + 1728)作为终止子，用引物在V端加上BamHI位点，在V端加上Pst丨位点， 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接，构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建：从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2，在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点，构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切，并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后，与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后，与含CYH抗性 基因的丨.1比？311-5&丨1片段（-184?+974)连接，构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到，用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域（+4?+356)和 3'区域（+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段，这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段，从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段，两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间，构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和？8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
该反应中，糖苷酶催化转糖基反应的得率，主要由糖葙受体、供体、酶浓 度和反应时间决定。表4-U和图4-19分别表示细杆菌H-1的分-FFase催 化甜菊双糖A苷转糖苷作用时，RA浓度和反应时间对其转化结果的影响。受 体甜菊双糖A苷浓度较低时，RA-F转化得率较商；甜菊双糖A苷浓度较大 时，RA-F产量下降。RA-F最大产量在反应开始不久得到，延长反应时间, 由于RA-F发生酶水解使得率下降。在RA0.025mOl/L，反应lh达到最大转 化率82%;当RA浓度0.5mol/L,反应21h,转化率为19%。
4，6, \\ 6'-四氣半乳糖基蔗糖是第 的碳水化合物衍生物，其甜度为蔗糖的200倍，通过三步处理法用磺酰氣对蔗糖进 行选择的氣化所得，见图3-59。在-30T的低温下，在嘧啶中用磺酰氣对蔗糖处 理，得到4, 6, 6'-三氣-衍生物。然后在-5T下使用1，3，5-三甲基苯磺酰 氣处理6d，选择性在c-r上发生取代，最后于140T下，在二甲基甲酰胺中用氣 化锂处理18h后转化为氣，即生成4，6, T, 四氣半乳糖基蔗糖。
