钦州市果糖
(二）通过葡萄糖发酵制备G-6 -a
1963年，R. S. Shallenberger提出甜味的AH、B系统理论。1972年Kier在 AH、B体系中又引进亲脂的第三结合点，即X疏水部位，并提出著名的AH、 B、X甜味三角理论，使AH、B系统理论得到了重大完善。甜味三角理论的形 成，很大程度上弥补了 AH、B双氢键假说的不足，特別是对强力甜味剂的解释 更具有说服力。因此，尽管这种理论也遭到一些人的怀疑，AH、B、X甜味三角 理论仍然是目前为止人类所能找到的最有效的甜味学说。
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶（GAP)基 因，其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh ￡co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段（-976? -1，推断+丨为翻译起始位点）作为启动子，用引物在V端加上N?d位点， 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段（+ 1006? + 1728)作为终止子，用引物在V端加上BamHI位点，在V端加上Pst丨位点， 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接，构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建：从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2，在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点，构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切，并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后，与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后，与含CYH抗性 基因的丨.1比？311-5&丨1片段（-184?+974)连接，构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到，用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域（+4?+356)和 3'区域（+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段，这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段，从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段，两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间，构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和？8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
浓度/( g/100m Lflm')
(一）BraMein表达载体的构建
植物嗦吗甜，经过SP-Sephadex离子交换层析及酸性屎素凝胶电泳后，完 全分离。提纯得到的两种主要的蛋白质，由TPCK修饰的羧甲基胰蛋白酶降解为 肽段（TPCK降低了胰凝乳蛋白酶活性），再经Cl8柱逆向HPLC分离，收集洗脱 液并测定氨基酸组成及序列后，根据已知嗦吗甜的一级结构（依据相似性）迸 行排序。比较后发现，这两种嗦吗甜中只有在46位上的氨基酸不同（分别为天 冬酰胺和赖氨酸），但它们均与已报道的嗦吗甜I和n序列不同，新序列分别用 嗦吗甜A、B表示。嗦吗甜A有1个或4个、嗦吗甜B有2个或3个氨基酸与嗦 吗甜I或II不同（表5-7)。
由于TCR在水中的最大溶解度仅为15%，使得棉籽糖酶解法合成三氣蔗糖 在经济上受到限制。因此，必须首先找到一种合适的TCR溶剂，要求它既能较 大限度地溶解TCR，又能保证《-半乳糖苷酶的活力。
选择以滴入的方式往环化剂溶液中添加三氧化硫溶液；三氧化硫为氨蓰磺酸物 质的量的5倍，环化反应温度控制在-25?30%之间，环化时间选用0.5h;水解反应 温度为-丨5尤，水解时间为丨.5h。选用上述优化条件，安赛蜜收率可达81.6%。
