郧西县甘草甜素
2-36所示，纽甜可以很方便地通过还原烷基化反应，由阿斯巴甜和 3, 3-二甲基丁醛制得。它是在钯（Pd/C)或铂（Pt/C)氢化催化剂的存在下， 用氢气处理阿斯巴甜和3, 3-二甲基丁醛的甲醇溶液来进行的。可以制得它的 无水化合物，但通常得到的都是单水合物，含4.5%结合水，经验分子式 ? H20，相对分子质谊3%.480图2-35 纽甜的化学结构^cho^apm-^ntm W2-36 通过3, 3-二甲基丁醛还原Af-烷基化制得纽甜
由于莫奈林分子中较为稳定的a-螺旋结构含量较少，其完整的三级结构因 而较易受到各种变性剂的迅速破坏。变性的结果导致了三级结构的无序化，分子 甜味随之丧失。但构象上的轻度变化是可以容忍的，并不会导致甜味的完全消 失。用十二烷基硫酸钠或50%乙醇溶液处理，造成货奈林蛋白质变性并失去了 甜味，分子中a-螺旋结构的含量有所增加。但用25%乙醇溶液处理，不会引起 构象和甜味的变化。莫奈林对碱十分敏感，值单独由于喊引起的变性而造成紧密 肽链结构的伸展现象还是可逆的。例如，pHlO.9环境下引起的变性，当用酸调 节至PH3.3时，其三级结构仍可恢复。此时，尽管分子的整体构象并没完全恢 复，但甜味却部分恢复了。
甜的结合物[丨38],有4个结合位置 Shallenberger - Acree - Kier的AH - B -
Jin等人通过考察更多的突变体，对上述数据进行了优化。ASp29Ala、 Asp29Lys、Asp29Asn和Glu4〗Lys这四种突变体都显示出了比天然Brazzein更为 显著的甜味特性。Ala2itw、A叩2Asn和Glnl7Ala这三种突变体则和天然的 Bmzzein —样甜。在另外8种突变体的甜味尽管明显下降，但仍然还是有味道 的，而有10种突变体，它们几乎和水一样无味，见图5-23。最近，Jiri等人又 通过把天然的Brazzein序列中一个特定Asp替换成Lys或Asu，所得产品的甜味 特性和甜度都有所增强。
A链：.梢?谷■异亮?赖.?酪?谷?酩?谷氨酰肢?(奚> ?酪?缬?酪?丙?背■天■賴 .亮?笨丙.潘?丙?天?异亮.丝.天.m w .甘.裕?賴.亮?龙.格 ?苯丙?天冬酰胺.甘.?缬?脯.M . ''tf B链：货?谷?色.谷?古4 ■异亮.天.异亮.甘? .苯丙.苏.谷氣m胺.天冬酸胺? ?
天然Brazzein的氨基酸序列缺少端蛋氨酸（甲硫氨酸）[图5-24 (2)]， 因此合成基因[图5-24 (3)]的第一个密码子前引人起始密码子Met。野生型葡 萄球菌核酸酶中含有4个蛋氨酸，经CNBr解离产生的肽链会影响Brazzein的分离 纯化，因此用快速定点突变将核酸酶基因（SNase)的4个Met的密码子用Ala的 密码子替换。SNase的4个蛋氨酸转化为己氨酸（正亮氨酸）对核酸酶活性没有影 响，SNase中蛋氨酸突变为丙氨酸会降低核酸酶的稳定性。经修饰后融合蛋白中只 有一个的蛋氨酸间隔SNase和SW K [图5-25 (2)],所得的融合蛋白表达水平 高并且核酸酶具有活性。在如-pGlul - Brazzein合成基因的5'和3'端分别加上 Ndel和BamHI位点，这样就可以克隆至任一 pET质粒。通过对天然核酸酶-卵类 黏蛋白融合基因表达质粒进行改造构建新的质粒。将Brazzein合成基因（SW基 因）插人pET-3a表达系统SNase基因C-端的Ndel和BamHI位点之间，得到质 粒PET-3a/SNase-SW [图5-25 (1)]0融合蛋A转录和翻译信号由T7表达载 体PET-3a产生，蛋白质在lac启动子的控制下生产。
糖楮钠-阿斯巴甜-甜蜜素钠（1:5:8)混合物与蔗糖在水溶液中的甜味分布 --蔗糖一糖格钠.W斯巴甜与甜蜜素钠的混合物
对转化体的胞内嗦吗甜含量测定后，发现在高产菌株中有较大一部分嗦吗甜 留在胞内。产率最高的菌株，胞内嗦吗甜含量约占总胞内蛋白的3%,且胞内嗦 吗甜也发生了部分降解。但在低产菌中胞内的嗦吗甜含量很低，这说明 A. awamori分泌系统?能已经超负荷，这就限制了嗦吗甜的产率。
