宾阳县海藻糖

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宾阳县海藻糖

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已知TCK只有在亲水的溶剂中才能高度溶解,但在保证酶解反应能得到 必要的水的前提下,a-半乳糖苷酶却被证明在与水不互溶的有机溶剂中, 最稳定并具有最高的活力。这个矛盾,可以通过使用被含水缓冲液预饱和的 有机溶液时得以解决。研究发现,高水混溶的溶剂如二氣六环、丙酮、甲醇 和四氢呋喃等,即使使用高达30%的含水缓冲液进行预饱和,也不支持 a-半乳糖苷酶的水解反应。但在含水缓冲液预饱和的正丁醉、甲基异丁基 酮和乙酸乙酯三种溶液中,TCR的溶解度均达到50%以上。这些溶剂同时 也支持a-半乳糖苷酶的活力,只是三者对三氣蔗糖的溶解性存在很大的差 別,如表3-9所示。
自然界存在各种变味剂,有的使水变甜(如朝鲜蓟),有的使酸味变成甜味 (如奇异果素,参见本书第五章),有的变苦甜味为酸味(如Bunudiadulcijlca)。 人们在吃蔗糖(不是糖精)之后会感到水有酸味,吃盐后感到水有酸苦味,在 适应酸苦味之后又感到水有甜味,在适应酸味后感到水有咸味。甜味肓患者对不同甜味剂感到有苦、酸或咸味。苦味肓患者对含有一C一NH和多硝基苦剂感 到有甜、酸味或淡而无味。用电极同时刺激味感相同的两个味细胞,则味感增 强,用以刺激味感不相同的两个味细胞,则这两种味感彼此抑制。这些特殊现象 往往很难用单纯的化学观点来解释,这是摆在有关研究者面前的一大难题,也是 对科学丁作者的莫大挑战。
酵母(BB25-UO 30*t. 72h
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶(GAP)基 因,其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh £co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段(-976? -1,推断+丨为翻译起始位点)作为启动子,用引物在V端加上N?d位点, 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段(+ 1006? + 1728)作为终止子,用引物在V端加上BamHI位点,在V端加上Pst丨位点, 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接,构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建:从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2,在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点,构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切,并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后,与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后,与含CYH抗性 基因的丨.1比?311-5&丨1片段(-184?+974)连接,构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到,用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域(+4?+356)和 3'区域(+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段,这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段,从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段,两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间,构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和?8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
大多数转葡糖基反应采用均匀酶反应体系,以可溶性淀粉或环糊精作为 葡糖基供体,葡糖基供体、受体均在溶液中,因此产物分离困难,并且反府 生成大童非目的还原糖。若以不溶的原淀粉为葡糖基供体,利用残留淀粉的 不溶性可以简化产物分离纯化工序,但原淀粉具有紧密的晶体结构,W此转 葡糖基反应速率和得率都很低。对原淀粉经挤压膨化处理后能以溶胀状态息 浮在水中,得到的反应体系与原淀粉相似,但反应速字和得率都比原淀粉反
图5-4 酵母嗦吗甜提纯工艺 (DTT 为 dithiothroitol)
通过将SCM基因克隆于带GADPH后动子和终止子的表达载体pGAP,然后 将其转化成S. DC04和DBY746,可生产出重组SCM及其突变体。利用
(一)酶法合成S-6-a的原理
Fuganti和Grasselli提出,用/V -苯乙酰基作阿斯巴甜的保护基团,因为 W-苯乙酰基可以很容易用靑霉素脱乙酰酶除去。该生产工艺中,D- PheOMe经外消旋作用后可重复利用,幣个工艺流程简单,且底物回收也简 单,因此可操作性很强,但酶(嗜热菌蛋白酶的粗制品)的回收很难。 Tosoh公司的研究者提出,将产物抽提到非水溶性有机溶剂后,再从反应混 合物中回收酶,但该法酶和产物的回收效果均不令人满意,因此在工业上很 难行得通。

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