宁化县阿力甜
构建的pRMll和pUMll中包含细菌质粒序列，因此经Bgl II酶切去除细菌 序列实现线性化后将促进载体在目标部位通过单交换取组（single crossover recombination)进行的整合，分别以质粒pCLRM216和pKMl 1所含的rDNA片段 和质粒pUMl 1所含URA3基因片段作为同源重组整合的目标序列。
在本研究中，VUsmeiei■试剂由PC15和冷冻DMF ( PC15质量/kg: DMF体积/L = 1:1.5)反应制得，反应中温度不超过50$。以Vilsmeier进行选择性氣化反应 时，温度最好为1丨5~125弋，因为温度过低，反应速度过慢；温度过髙，易造
Sarroch Theemsilp等还根据分子组成计算了分子质苗：。奇异果素的氨基酸部 分的分子质量为21257u，糖组分约占13.9%，因此总分子质鱼为24600U (约 25ku)，该值是由SDS - PAGE估测的分子质世28000u的88%。对于奇异果素分 子质量，若采用的测定方法或样品不同，结果也不同。在尚未得到纯样品时，根 据粗样品采用不同方法测得的奇异果素分子质迸均约是25ku的2倍。如用SDS -PAGE测定的未还原奇异果素的分子质谊为43kii，约是根据氨基酸组成及糖类 成分计算的分子质萤25ku的2倍。奇异果素的粗提物用0. 5mol/L NaCl从Sepha- dexG-75柱洗脱后，发现分子质世为52ku处的组分具有变味活性。在无DTT 的SDS-PAGE中，在431oi处有一条宽带，而奇异果素还原后，在28ku处有宽 带。天然奇异呆素用低角度激光散射（low angle laser light scattering)测定的分 子质量为90ku。这些结果表明天然粗奇异果素是25ku-肽的二聚体，纯奇异果 素娃该肽的四聚体，有可能杂质使得奇异果素二聚体难以聚合成为四聚体，并发 现奇异果素的纯四聚体和天然二聚体都有变味活性。
阁5-23野生型Brazzdn的带状图
起初在对小鼠/人体嵌合体的研究中，这些作者发现受体对lwtisole敏感的 分子基础只是人体T1R3原体的TM区域内的一些残基而已。用丙氨酸替换人 体T1R3 TM K域的残基，结果表明，有4个关键残基是受体对lacUsole产生敏 感性所必需的。人体T1R3 TM区域的分子建模和lactisole与假设的结合口袋的 自动对接研究证实了这一抑制剂与含有四个关键残基的跨膜域内的结合口袋是 对接的。
Kondo等人曾尝试构建一 SCM质粒并在C— idilis中生产SCM。他们把 SCM基因插入由产脘假丝酵母(C. utUis)克隆来的GAP基因的启动子和终止子 片段之间。通过这种方式，他们获得了高产虽的SCM，表达水平高于总可溶性 蛋白的50%。他们还尝试克降带S. cerevisiae GAPDH启动子的SCM基因用来生 产SCM。然而，所得的产最水平很低，仅为总可溶性蛋白的5%左右。美国一专 利公开了利用P. pastoris生产SCM的方法。首先将合成的SCM基因克隆于含有 S. cerevisiae a -因子分泌信号和GAPDH启动子的PGAPZa -载体，然后将构建的 质粒转化成P.P^tori5GS115，最后通过菌株对Zcocin的阻抗性，对转化株进行 筛选。观察发现所分泌的.1：组英奈林为一条12kji的带。SDS - PAGE分析表明， 通过该方法可获得约10g/L的SCM。这些SCM经纯化后可引起甜味。
酵母分泌嗦吗甜，是生产嗦吗甜另一种方法。植物嗦吗甜也由分泌产生，因 此可以模拟植物嗦吗甜的产生过程进行酵母嗦吗甜生产。而且植物和酵母的胞内 环境及输出蛋白折香、形成二硫键的细胞机制相似，因此可以推断分泌的嗦吗甜 也将具有甜味构型。将嗦吗甜丨、A、B的基因分别接在一密码序列的1末端， 该密码序列引导嗦吗甜进人细胞膜分泌途径，并最后分泌到培养基。
六、利用基因工程法合成阿斯巴甜
图6-6 糖精的水解产物
