洞口县蔗糖素
(2)PK. 477bp； P^, 761 bp； P-. 880bp； 750bp。
(四）以异氰酸环己酯和硫酸为原料
+NH2S0,Na ?QH.jNHSOjNa + NH3 t
图6 - 9 80T时糖精钠的水解曲线
第三章蔥精衍生物
尽管可以“辨别”出蔗糖8个羟基之间的微小差别，但这距有效利用这 些细微差别，以避免蔗糖在部分衍生过程中的产物复杂化还很遥远。严格控制 反应条件，包括降低温度，调节PH，使用大分子取代基团等手段，尽管可以 提高蔗糖部分衍生反应的专一性，怛各种副产物的产生仍将不可避免地给分离 工作带来巨大闲难。因此，充分考虑到这些特性，在反应路线的设计中选择某 些必要的方法，保护蔗糖分子中某些特定位置1：的羟基，而让活性较小的羟基 参加反应，最后再以轻度的反应条件将受保护位置上的基团除去，从而达到预 期的目的;>
四、Brazzein的应用
使用产物沉淀法，当L - PheOMe过贵时在水溶液反应也能有很髙的得率， 其中Z - L - Asp - L - PheOMe与L - PheOMe形成不溶性沉淀。各取底物 2?10mL水中混合，并加人10mg嗜热菌蛋ft酶，起始pH6~8，在 概保持3 ~5h可得到Z-L-Asp-L-PheOMe ? L - PheOMe白色沉淀，该沉淀 得率大于95%。研究还发现，以外消旋化合物为反应底物时，只有L-PheOMe 参与缩合反应得到产物为Z-L-Asp-L-PheOMe，但D - PheOMe也能与Z-L- Asp-L-PheOMe形成沉淀。根据这些研究结果，Tosoh公司开发了生产工艺流程 (图2-20)，并在1984年完成了中试。
质粒pET-3a/SNase-SW转化至大肠杆菌BL21 (DE3) /pLysS菌株进行表 达。采用pLysS菌株可以消除引人前核酸酶的不利影响，更有利于核酸酶- Brazzein融合蛋白的表达。转换后在37T加人100|xg/mL阿司匹林、34jjig/mL氣 霉素的Luria培养基（LB)中培养一段时间后，加人IPTG后培养2~3h，大肠 杆菌中分子质萤23ku的融合蛋白产量达到最大，多数在内含体沉积，在16%的 Tricine凝胶中50%?70%的融合蛋白不溶。内含体蛋白经电泳凝胶提纯后，大 部分融合蛋白重新折黉(refolded),提纯纯度> 80%。经CNBi?处理后， 50%?70%融合蛋白发生解离，这说明融合蛋「丨不能完全解离。因Brazzein酸性 较强，p/约5.4，而核酸酶碱性较强，p/9.4，因此融合蛋白解离后用阳离子交 换色谱即能分离产物。纯化得到的重组Brazzein具有较高纯度及正确的分子质量 (6.4ku)0解离后得到的肽链与^-pGlul -Brazzein序列相同，甜度是植物提 取Brazzein的2倍，与从植物中分离得到的如-pGlul - Brazzein甜度相当。已 研究表明蛋白质只有在折垒正确时才具有甜味，未折垒(unfolded)或折奋错误
