灵宝市安赛蜜
(4)乙酰乙跣胺-氟硫酰氟法。
达到稳定状态。这一空穴组成了一个有別于可容纳小分子甜味剂的两个活性位点 的二级结合部位。这个用于解释甜味蛋白相互作用机理，称为“楔形”模型， 最初楚在对Brazzein、莫奈林和嗦吗甜与受体的同源模型进行对接计算的基础上 提出来的。
②丨4个单代动物试验（包括几种受试动物）的结果均表明，即使摄入相当 高剂量的糖精，也不会诱发任何器官的癌变。
大多数转化体培养72h时嗦吗甜产率达到最高，72h后产率明显下降（图 5-8)。但双转化体TB2bl-44-GD5的产率在72h后仍继续增加，这是由于它 的gdhA启动子与生长期同步表达，而酯酶B2启动子在生长期结束后表达，因 此当晚表达的启动子（如次级代谢的启动子）也能被Aauwnori转录机制识别 时，将一早一晚表达的启动子结合也许就吋以延长基因的表达时间。TGDTh-4 以硫酸铵为氮源培养48h时嗦吗甜分泌量达到最髙，这是因为它采用的 A. awamori的gdhA启动子通常较早表达。
从植物中分离得到的Brazzein有几种结构，其中主要构型中的末端氨基酸 是焦谷氨酸（pGlu)[围5-24 (1)]0另一构型除末端没有该氨基酸外，其 余均相同，称为de8-pGlul -Brazzein [图5-24 (2)]t它的甜度是主要构型 的Brazzein的2依。按des - pGlul - Brazzein的氣基酸序列采用大肠杆菌优选 密码子合成的基因如图5-24 (3)所示。合成的Bra^ein基因若直接克隆至 质粒 pET-3a、pET-9a、pET - 1 la 和 pET - 16b 得到的 Brazzein 表达水平均 很低，只有pET-3a和pET-9a得到少量可溶的Brazzein。pET载体通常能使 外源可溶性蛋白如葡萄球菌核酸酶表达，葡萄球菌核酸酶与Brazzein的显著不 同是葡萄球菌核酸酶的氨基酸数目>100，且没有半胱氨酸或半胱氨酸含S很 低。若采用两种基因融合生产目的蛋白融合体的表达水平较髙，因此将 Brazzein合成基因插人葡萄球菌核酸酶表达系统。该策略经大肠杆菌生产鸟类 卵黏蛋白区证实很成功。
在非均匀酶反应体系中还原糖含量约0.3g/L，而以液化淀粉为葡糖基供体 的传统反应体系中，该值约为8.0g/L。上述结果表明非均匀反应体系中转葡糖 基产物的分离纯化过程会明显简化。
Soejarto等人还对巴拉圭甜叶菊产区居民做深入调査，发现无论是久居此地 还是刚迁移入的居民均没将甜叶菊当避孕药使用的例子。有些报道及一些早期的 试验还列举了南美洲印第安人，特別是巴拉圭人，用作避孕药的几种植物，均未 发现有甜叶菊。唯一的一种解释是，Planas和Kue所提到的避孕作用是由于植物 中甜物质以外的某些成分的作用结果。
通过研究发现核糖体L41蛋白中的第56位氨基酸决定了酵母对CYH的敏感 性或抗性。56位氨基酸为谷氨酰胺时该蛋白为抗性蛋白，56位氨基酸是脯氨酸 时为敏感型蛋由。这也在CYH抗性酵母Candida mallosa、Kluyveromyces lactis和 Schwanninomyces cerevisiae 的 L41 蛋白得到了证实。对于 CYH 敏感型 Saccharomy- ces cerevisiae^将其L41蛋白第56位氨基酸的密码子用谷氨酰胺的密码子替换后， 细胞就具冇了 CYH抗性。
Brazzein在植物甜蛋白中分子质虽最小，分子质萤约为6473u, p/为5。它 具有良好的水溶性，在水中的溶解度在50mg/mL以上，甜度是等质虽蔗糖的 2000倍。其结构相对简单并具有良好的热稳定性和PH稳定性，在较宽的1^和 温度范围内保持稳定，在80T保持4h甜度没有减弱，在85弋仍保持折叠形式, 在髙pH的溶液中仍保持甜味活性。它良好的热稳定性也许应归因于分子内的4 个二硫键。由于这些特性使其在食品添加剂中具有巨大的应用潜力，并成为研究 甜味蛋白分子结构、生化特性及甜味机制的理想蛋白模型。
