开封市纽甜
酯化反应的条件取决于酯化试剂的特性，如与乙酸酐反应时受吡啶等杂环胺 的影响。试验表明，若酯化反应在催化剂催化、无水和极性非质子传递溶剂中进 行，可得到较高得率的蔗糖单酯化物。蔗糖和乙酸酐在弱碱性条件（如吡啶溶 液）下很容易反应，单酯化物的得率较高。但在含水的强碱性条件下，蔗糖和 乙酸酐反应更容易生成多酯化物。尽管蔗糖的酯化反应也可以在酸性环境中进 行，但酸性环境容易导致蔗糖的水解。
本研究用二甲基甲酰胺（DMF)和氣化亚砜制备Vilsmeier试剂，此反应为 放热反应。将8.4mLDMF预冷至0T，加入8.5mL氣化亚砜，搅拌反应30min， 温度控制在50弋以下。反应结束后加人lOOmL DMF，将混合液冷却至Ot,在 20T：以下缓慢加入15g6-PAS (Vilsmeiei?试剂：6-PAS =4:1),在0弋下保持 15min0慢慢升温至70T,通人氮气来赶走部分HC1，此温度下维持30min后再 逐渐升温至100?12(rC，恒温反应3~5h,趁热以活性炭脱色，浓缩滤液，冷却 后有晶体析出。待结晶完全后过滤，用无水乙醉重结晶，得到白色针状晶体，为 4，丨\ 6'-三氣-4,丨\ 6、三脱氧-2, 3, 6，3\ V-五乙酸半乳蔗糖醋 (TOSPA)。
阁3-丨8乙酸浓度及反应时间对 6-PAS产率的影响
天然Brazzein的氨基酸序列缺少端蛋氨酸（甲硫氨酸）[图5-24 (2)]， 因此合成基因[图5-24 (3)]的第一个密码子前引人起始密码子Met。野生型葡 萄球菌核酸酶中含有4个蛋氨酸，经CNBr解离产生的肽链会影响Brazzein的分离 纯化，因此用快速定点突变将核酸酶基因（SNase)的4个Met的密码子用Ala的 密码子替换。SNase的4个蛋氨酸转化为己氨酸（正亮氨酸）对核酸酶活性没有影 响，SNase中蛋氨酸突变为丙氨酸会降低核酸酶的稳定性。经修饰后融合蛋白中只 有一个的蛋氨酸间隔SNase和SW K [图5-25 (2)],所得的融合蛋白表达水平 高并且核酸酶具有活性。在如-pGlul - Brazzein合成基因的5'和3'端分别加上 Ndel和BamHI位点，这样就可以克隆至任一 pET质粒。通过对天然核酸酶-卵类 黏蛋白融合基因表达质粒进行改造构建新的质粒。将Brazzein合成基因（SW基 因）插人pET-3a表达系统SNase基因C-端的Ndel和BamHI位点之间，得到质 粒PET-3a/SNase-SW [图5-25 (1)]0融合蛋A转录和翻译信号由T7表达载 体PET-3a产生，蛋白质在lac启动子的控制下生产。
当S -6 - a达到最大得率时，可通过DEAE -纤维素树脂除去果糖转移酶， 或通过热变性（65弋、lOmin)作用来终止反应。最后，S-6-a经高效液相色 语（固定相为Cl8柱，流动相为水）的分离提纯作用可以获得纯度大于85%的
(4)通过?-(3，3 - 二甲基丁基）-L-a-天冬氨酸-0-酯羰基酸酐和 L-苯丙氨酸甲酯缩合来制备。其中；V-(3, 3 - 二甲基丁基）-L-a-天冬氨 酸-j8-酯羰基酸酐由iV-(3, 3-二甲基丁基）-L-ck-天冬氨酸-卢-酚和碳酰 氯反应而制得。
(2)PK. 477bp； P^, 761 bp； P-. 880bp； 750bp。
有人曾用酶法和化学法合成过蔗糖，也用类似的方法合成过自然界不存在的 L-蔗糖（图1-2)。然而令人惊奇的是，L-蔗糖与自然界天然存在的D-蔗糖 一样甜。L-蔗糖与D-庶糖在立体化学上呈镜像关系，是由L-果糖和L-葡萄 糖缩合而成。重要的是，L-果糖和L-葡萄糖-样也是甜的。由于L-糖不参 与人体代谢，W此令人很感兴趣，只要经济上合算，就可作为新型功能性甜味剂 加以开发。
