张湾区木糖醇
不同的Candida utilis菌株电脉冲转化的效率有较大不同。将Bgl D酶切后的 PCLRE2通过电穿孔转化至ATCC9256和ATCC9226，都能得到CYH抗性菌落， 多拷贝载体DNA也串联整合至rDNA区，但转化率都不到ATCC9950的10%。 整合至ATCC9256的pCLRE2拷贝数为6~8，整合至ATCC9226的拷贝数为 5-9,整合至ATCC9950的拷贝数为10?12。
选用三苯中基化和乙酰基化反应，来完全保护蔗糖的8个羟基。具体操作方 法是，在500mL圆底烧瓶中，依次加人20g蔗糖粉（0.058mol)和80mL 二甲基 屮酰胺，磁力搅拌并升温至50?65T使蔗糖完全溶解，再加入24g/V-甲基吗啉 (0.236mol)。分3次在3h内加人56. 8g三苯基氣甲烷（0. 197mol)，恒温反应 3.0-4. 5h0
质粒pET-3a/SNase-SW转化至大肠杆菌BL21 (DE3) /pLysS菌株进行表 达。采用pLysS菌株可以消除引人前核酸酶的不利影响，更有利于核酸酶- Brazzein融合蛋白的表达。转换后在37T加人100|xg/mL阿司匹林、34jjig/mL氣 霉素的Luria培养基（LB)中培养一段时间后，加人IPTG后培养2~3h，大肠 杆菌中分子质萤23ku的融合蛋白产量达到最大，多数在内含体沉积，在16%的 Tricine凝胶中50%?70%的融合蛋白不溶。内含体蛋白经电泳凝胶提纯后，大 部分融合蛋白重新折黉(refolded),提纯纯度> 80%。经CNBi?处理后， 50%?70%融合蛋白发生解离，这说明融合蛋「丨不能完全解离。因Brazzein酸性 较强，p/约5.4，而核酸酶碱性较强，p/9.4，因此融合蛋白解离后用阳离子交 换色谱即能分离产物。纯化得到的重组Brazzein具有较高纯度及正确的分子质量 (6.4ku)0解离后得到的肽链与^-pGlul -Brazzein序列相同，甜度是植物提 取Brazzein的2倍，与从植物中分离得到的如-pGlul - Brazzein甜度相当。已 研究表明蛋白质只有在折垒正确时才具有甜味，未折垒(unfolded)或折奋错误
当带嗦吗甜基因的质粒转移人酵母，在选择性培养基上培养一段时间后， 在相应的培养基中发现了甜味嗦吗甜A、B,且分子质粗均与成熟嗦吗甜的分 子质量相同。嗦吗甜I虽用同样方式生产，但没有出现在培养基中，该结果与 它不能在体外折叠相符。由此可以看出单个氨基酸变化对蛋白质结构影响 很大。
在目前已有的各种合成三氣蔗糖的方法中，棉籽糖水解法受到人们的关注。 虽然从技术和经济方面考虑，这种方法目前离实用阶段尚有一定的距离，却为三 氣庶糖的合成提出了一种新的思路和方法，具有较高的理论研究价值和应用前 贵。棉籽糖水解法中的氣化衍生过程与化学方法一致，这姐仅对其中的酶法水解 部分做详细的研究和探讨。
上述体外分析结果，与动物体内试验及人体试验结果没有联系。
图2 -45 17mg/L纽甜和525mg/L阿斯巴甜水溶液的瞬时甜味分布(2)滞后时间、，即强度达到超过基线水平所需的时间（s):阿斯巴甜 1.3,纽甜 1.5。(3)达到最大钱度所需的时间(s):阿斯巴甜丨2.3,纽甜丨6.6。(4)最大强度持续时间(s)：阿斯巴甜6.1，纽甜2. 8(5)结束时间即强度回到基线水平所需的时间（0:阿斯巴甜80.5, 纽甜94. 8 o(6)曲线下总面积(以强度单位x时间表示）：阿斯巴甜425，纽 甜49丨。.
