紫金县二氢查耳酮
Unilever已成功地生产出嗦吗甜II及嗦吗甜分子的前体化合物，这一杰出成 就是通过多年的努力，应用遗传工程方面的最新知识完成的。有两篇专利文献对 这种生产方法做T相当详细的描述。其中一篇描述的娃利用重组DNA技术把植 物基因的遗传信息引人大肠杆菌{Escherichia coli)细菌寄主细胞内，将“设计 好”的DNA适时移人细菌体内就可生成嗦吗甜蛋白。第?.篇描述的是重组[)NA 分子的结构，它可产出嗦吗甜分子的前体化合物。嗦吗甜D分子的氨基末端有额 外的22个氨基酸，羧基末端也冇额外的6个氨基酸。这种伸长的分子有助于微 生物细胞更易排出蛋白质，因此增加了应用时的经济效益。遗传工程的另一个任 务就是通过基W突变使嗦吗甜分子发生特种变异，以观察其对产品甜度及其他特 性的影响。然而，就H前来说，要把这些实验成果转变成商收化规模生产尚冇不 少困难。另一种适合用来生产嗦吗甜的寄主是酵母或其他无毒性的发酵微生物， 因酵母的食用历史很长，对有关管理部门以及最终消费齐来说吸引力更大些。
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶（GAP)基 因，其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh ￡co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段（-976? -1，推断+丨为翻译起始位点）作为启动子，用引物在V端加上N?d位点， 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段（+ 1006? + 1728)作为终止子，用引物在V端加上BamHI位点，在V端加上Pst丨位点， 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接，构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建：从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2，在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点，构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切，并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后，与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后，与含CYH抗性 基因的丨.1比？311-5&丨1片段（-184?+974)连接，构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到，用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域（+4?+356)和 3'区域（+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段，这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段，从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段，两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间，构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和？8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
一、莫奈林的化学结构
纽甜保留了阿斯巴甜的许多优良特性，如纯正的甜味、良好的味觉分布与 风味增强性质、无能量、无致龋性、在酸性介质下稳定等。不仅如此，它还在 很多方面优于阿斯巴甜，如表2-21所示。在干燥的条件下，纽甜具有更长的
②3个伯位羟基团脱去三苯甲基，消除屏蔽。
第二章高效甜味肽
立体选择性催化氢解纽甜酯的脂肪酶和酯酶可以分别通过黑曲锥(Aspergillus niger)、米曲霉(AspergUlus oryzae)、南极洲假丝酵母（Candida anlarctica)、 柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、产朊假丝酵母(Candida utiiis)、娄地靑祗 (Penicillium roqueforti) x 洋葱假第胞菌(Pscudomonas ccpacia)、少根根箱(Rhi- zopus arrhizm )、水生嗜热杆菌（Thermus aquaticus )、小麦胚芽、假单胞菌 (Pseudomonas sp. )、B 型假单胞傲(Pseudomonas sp. type B)、芽抱杆菌(Bacil- lus sp. ) x咕热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、猪肝、马肝、兔肝以 及酿酒酵母(Saccfmwmyces ce—、等获得。一般脂肪酶首选B型假单胞菌 (Pseudomonas sp. type B)，醋酶首选从猪肝提取（表2 - 26) 0
④YPD平板培养基上期落数计为活细跑数。
对嗦吗甜基因进行体外突变，或插人合成低聚核苷酸罝换DNA序列或在体 外诱变，得到大量突变基因。这些突变基因克隆至酵母，使其分泌嗦吗甜。大多 数这些带突变基因的质粒能使酵母分泌变异嗦吗甜，但也有些质粒中没有插人使 嗦吗甜分泌的DNA序列，也没有能使嗦吗甜发生折番复性的突变。
