福清市甘露醇
图6 - 1糖楮、糖楮钠和糖梢钙的化学结构
(1)以环己胺和氨基磺酸钠为原料
植物嗦吗甜，经过SP-Sephadex离子交换层析及酸性屎素凝胶电泳后，完 全分离。提纯得到的两种主要的蛋白质，由TPCK修饰的羧甲基胰蛋白酶降解为 肽段（TPCK降低了胰凝乳蛋白酶活性），再经Cl8柱逆向HPLC分离，收集洗脱 液并测定氨基酸组成及序列后，根据已知嗦吗甜的一级结构（依据相似性）迸 行排序。比较后发现，这两种嗦吗甜中只有在46位上的氨基酸不同（分别为天 冬酰胺和赖氨酸），但它们均与已报道的嗦吗甜I和n序列不同，新序列分别用 嗦吗甜A、B表示。嗦吗甜A有1个或4个、嗦吗甜B有2个或3个氨基酸与嗦 吗甜I或II不同（表5-7)。
图2 -93带有芳香箪闭取代基二肽甜味剂的L-型构象图
七、倍半萜烯化合物
需说明的是，本章集中讨论的数种人工合成甜味剂，指的是纯粹的人工合成 品，就连其合成原料都不是食品或食物的天然成分。这样单独列章的目的是为了 讨论上的方便，并不是说前面几章讨论的都是天然产品。事实上，前面讨论的部 分甜味剂品种，诸如阿斯巴甜、阿力甜和三氣蔗糖等，都属于合成产品范围内。 与本章不同的是，它们的合成原料，诸如天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和蔗糖
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶（GAP)基 因，其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh ￡co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段（-976? -1，推断+丨为翻译起始位点）作为启动子，用引物在V端加上N?d位点， 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段（+ 1006? + 1728)作为终止子，用引物在V端加上BamHI位点，在V端加上Pst丨位点， 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接，构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建：从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2，在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点，构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切，并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后，与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后，与含CYH抗性 基因的丨.1比？311-5&丨1片段（-184?+974)连接，构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到，用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域（+4?+356)和 3'区域（+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段，这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段，从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段，两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间，构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和？8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
人工合成甜味剂的缺点，集中体现在以下两点：
_法合成的缺点：①它的投料浓度与产物浓度一般都很低，生产张度低，物料处理量大，能 耗大，酶的回收困难；②酶法尚无法独立完成阿斯巴甜合成的全过程，其甲酯化仍需用化学法， 在生产过程需兼具化学法和酶法两套工艺。
表S-19 仙茅蛋白提纯工艺
